HRP是由糖蛋白主酶和亚铁血红素辅基组成的一种复合物，催化的反应式为：DH+HO→D+2HO，作为供氢体的化合物较多，有邻苯二胺、四甲基联苯胺、5-氨基水杨酸等。其中，四甲基联苯胺具有稳定性好，成色反应无需避光，无致突变作用等优点，是目前ELISA中应用最广的底物。碱性磷酸酶的作用底物为对硝基苯膦酸酯；β-半乳糖苷酶的作用底物为4-甲基伞酮-β-D-半乳糖苷。