甲氨蝶呤的血浆蛋白结合率为50%~70%，与血浆蛋白结合率较高的药物如水杨酸类、保泰松、磺胺类、苯妥英钠、四环素、氯霉素等药合并应用，可使甲氨蝶呤的血浆蛋白结合率下降,游离型药物增加，而使其血浆药物浓度增高。弱酸性药如丙磺舒及水杨酸类，可竞争性地抑制甲氨蝶呤的肾小管分泌，减慢其排泄，使其维持高血浆浓度状态，易致中毒。与青霉素合用时，甲氨蝶呤从体内排泄可明显减少，可能导致甲氨蝶呤中毒。