三糖铁琼脂培养基中乳糖、蔗糖位于斜面，葡萄糖位于底层。大肠埃希菌发酵葡萄糖、乳糖产酸产气，发酵蔗糖因菌株而异，硫化氢试验为阴性。大肠埃希菌在三糖铁琼脂培养基上斜面产酸或不产酸(+／-)、底层产酸(+)、硫化氢试验（-）。氢化钾(KCN)试验、尿素酶试验为阴性。