平板划线分离细菌的目的是将混杂的细菌在平板表面分散开，经过培养后获得单个菌落，以便对单个菌落的细菌进行进一步的研究和鉴定。所以平板划线分离细菌成功的标志是培养出单个菌落，选项C正确。选项A：Ⅰ区和Ⅱ区不相连只是平板划线操作过程中的一个要求，并非成功的标志。选项B：有明显的三区划线只是操作规范的体现，不是成功标志。选项D：不能划破培养基是平板划线的操作注意事项，不是成功的标志。选项E：不能有污染菌生长是对实验结果准确性的要求，但不是成功分离出单个菌落的标志。